PCR实验室设计标准和施工方案

发布时间:2020-06-01浏览:

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  PCR实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)的简称。是一种分子生物学技术,用来放大指定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。按照DNA基因追踪系统,能快速了解病人身体内的病毒含量,其精确度更是高达纳米级别,精准检测乙肝病毒在病人身体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判定病人最合适使用哪类抗病毒药物、判定药物疗效怎么样、给临床治疗提供了安全可靠的检验依据。
  
  PCR实验室主要实验项目:病毒检测,乙型肝炎,禽疫病,癌基因的检测和诊断,DNA指纹,个体识别,亲子鉴定及法医物证等。

PCR实验室设计
  
  现阶段PCR运用已取得长久的发展壮大,已变成疫病诊断,疫情控制等层面的有力工具,为了能规避在PCR方法中发生污染及发生假阳性和假阴性结果等状况,确保结果的精确性,在实验室环境安全控制上严苛保证实验室独立区域设计,功能分区明确,确保实验室洁净环境,人流物流严苛分流,设计合理的压力梯度,建立有序的气流组织方向,切实保证规避交叉污染。
  
  规避污染是PCR实验室设计建设首先考虑关键
  
  因为PCR技术的高度敏感性,PCR技术要求高、影响因素多,从样品制备到结果的形成,任何一处细微的差错均会造成结果的偏差,造成样品的假阳性和假阴性结果。
  
  PCR实验室研究过程中,许多 操作都会形成气溶胶,例如离心、混匀等操作闵。为确保环境安全,PCR实验室设计建设需独立区域设计,规避与其余环境的交叉混杂,以下黛仁净化按照我们做过的工程案例从平面布局、净化区域划分,人物流设计和压差控制等层面具体化讲解。
  
  一、PCR实验室标准规范
  
  《实验室生物安全通用要求》国家标准GB19489-2008
  
  《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文
  
  《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文
  
  《临床基因扩增检验实验室设计标准》卫医发[2002]10号文附件
  
  《基因检验实验室技术要求》国家质监检验总局SN/T1193-2003
  
  《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》国际标准ISO14698
  
  《洁净厂房设计规范》国家标准GB500732013
  
  《洁净室施工及验收规范》GB50591-2010
  
  《室内空气质量标准》国家标准GB/T18832002
  
  《生物安全实验室建筑技术规范》国家标准GB50346-2011《病原微生物实验室生物安全管理条例》卫生部(2004-11-12)
  
  二、PCR实验室区域划分
  
  PCR实验室建设按照规定分成四个独立的工作区域:试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。

PCR实验室区域划分
  
  1、试剂准备区:用以试验试剂的准备。
  
  该区域为正压,作用是避免污染物质溢入。该区域里面又可分成3个区域:普通提取试剂的准备区、PCR试剂准备区和PCR主反应液准备区。在普通提取试剂的准备区内准备一些样品核酸提取时所需的裂解液、提取液等;PCR试剂准备区用以PCR试剂的制备和保存。例如准备引物、探针等PCR试剂。为了能避免交叉污染,避免反复冷冻和解冻,试剂存贮溶液应当被平均为小的工作体积,存储在这个房间内以便后用:PCR主反应液准备区将实行主反应混合液(除了样品。所有的PCR所需试剂的混合)添加到PCR管的操作。重要提示:不可以将其他房间内的材料(包含扩增、模板和目标核酸或阳性对照、供应品、或设备)带进试剂准备区。
  
  2、样品准备区:该区域无压力设定要求。
  
  该区域是用以对样品实行分样,将样品实行研磨、粉碎、匀浆的区域。考虑到在这些粉碎、研磨和匀浆处理过程中会产生气溶胶,因而,存在阳性样品污染后续操作的可能性。该区域与后边的区域应严苛隔离,应放到与后边的3个区域隔开的独立的房间内中。在样品准备区内还可开设1个专门的封闭区或房间内用以样品的接收和存储。这一房间内能够摆放冰箱用以样品存储,应当和样品准备区其他区域隔离开。样品准备区域的工作人员不能进到试剂准备区。
  
  3、核酸提取区:核酸提取区是实行样品核酸提取的区域。
  
  该区域为负压,作用是避免核酸外溢导致污染。样品准备区又包含从样品中实行核酸提取和纯化的区域及其将核酸加到包含PCR主反应混合液管中的操作区域。添加完样品后,PCR管的盖子要尽量快地盖好。使用PCR板和胶盖时,阳性对照和含目标序列的样品要与待测样本分开操作,以避免模板添加时导致交叉污染
  
  重要提示:这一房间内里的一切物品不能带人试剂准备区。
  
  4、扩增和产品检测区:该区域是用来实行PCR扩增和PCR分析。
  
  PER仪摆放在这个区域。房间内保持负压,作用是避免核酸外溢。在该区域工作人员一定要始终穿戴工作服和手套,在离开房间内前脱掉,避免扩增子污染其他地点。所有的用以扩增和产品检测的设备要特定用以这一房间内。PCR分析]二作也设定在该区域,例如:酶切、测序、克隆等,但实验室应尽量把这些活动分隔在不同区域或不同房间内。以降低扩增产物的污染风险。要是没有条件在该区域开设负压,此区域必须建立排风装置。
  
  三、PCR实验室设计要点
  
  PCR实验室能够是分散方式,还可以是组合方式。完成1组PCR实验,通常情况下应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程,若实验工艺需要,还应添加样品粉碎过程。
  
  1、分散方式PCR实验室
  
  所谓的分散方式PCR实验室,就是指完成以上所述实验过程的实验用房彼此之间距离较远,呈分散布置方式。针对这种布置方式的PCR实验室,考虑到每个实验相互间不容易相互干扰,因而无须特殊条件要求。
  
  2、组合方式PCR实验室
  
  所谓的组合方式PCR实验室,就是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置,组成独立实验区域的方式。针对组合方式PCR实验室,考虑到每个实验间集中布置,很容易导致相互干扰,因而,对总体布局及其屏障系统具有相应的要求。各室在入口处设缓冲间,以降低室内外空气交换。

PCR实验室气流设计方案
  
  四、PCR实验室气流设计方案
  
  人流物流设计方案各行其道,避免交叉混杂,整体区域设计方案1个公用走廊,工作区域相互间设计方案试剂物品传输专门窗,保证人物分流。
  
  1、物流:在试剂准备区与标本制备区、标本制备区与PCR扩增区相互间,及其扩增区域和纯化区相互间设计方案有电子连锁不锈钢传递窗,以单向实行试剂、标本等物品传送,配制的试剂通过单向传递窗由试剂准备区传输到标本制备区,处理过的标本通过单向传递窗由标本制备区传输到PCR扩增区,按照工艺流程逐次传输,避免返流。单向物品传送系统既确保了标本试剂不受污染,又确保了标本试剂不污染环境。
  
  2、人流:工作人员通过闸间分别进到各自实验区域,出入各实验区域需要在闸间区域更换洁净服,洗手消毒等。
  
  五、PCR实验室压差设计
  
  PCR实验室应设计为负压洁净室,通过压差操控,使整个PCR实验全过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并且降低扩增产物对人员和环境的污染。
  
  每个实验室与非洁净区之间的闸间保持正压,>10Pa,实验与闸间之间的气流组织方向为:试剂准备区空气流向闸间,标本制备区流向闸间,而PCR扩增区气流方向由闸间流向PCR扩增区,纯化区同理;
  
  同时按照试剂单向流方向,每个实验室之间设计不同压力梯度来实现单向气流组织方向,由试剂准备区(+20Pa)、标本制备区(+15Pa)、扩增反应一区(-5Pa)、纯化区(-10Pa)、扩增反应二区(-20Pa)、到后纯化区(-25Pa)压力逐渐降低,形成单向负压压力梯度。
  
  六、PCR实验室污染的预防与操控
  
  PCR实验室设计的关键难题是怎样避免污染。在现实工作中,普遍的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。因为一旦发生污染,实验就必须要停止,直至找出污染源才行,并且实验结果必须要作废,需再次采取实验。因而发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时并且繁琐,浪费人力物力。因而要避免污染,首要应是预防,而不是排除。
  
  1、运行区域的严格划分
  
  (1)每个实验区域设置合理;
  
  (2)每个实验区域要有显著的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免每个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。
  
  2、合理的系统设置
  
  (1)合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统;
  
  (2)严格的气流压力操控,确保不同的实验区内不同的压力要求。
  
  3、规范的实际操作
  
  (1)扩增检验实验室的技术人员必须要采取上岗培训,经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的运行;
  
  (2)在实验操作全过程中,操作者必须要戴手套,并时常更换。除此之外,实际操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施;
  
  (3)清洁运行及时、正确。实验运行结束后,必须要立即对本区采取清洁。除常规的消毒液体对表面采取擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外,对某些实验设备还应采取高压消毒处理。
  
  4、严格的管理
  
  (1)严格控制出入实验室的人员。与实验不相关的人员不能随意出入实验室,有条件的情形下要设置独立的通道和出入整个实验区的门;
  
  (2)尽可能减少在实验区内不必要的行走以减少交叉污染的可能性。
  
  (3)扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不可以在实验室中乱倒,必须要经消毒液浸没消毒后在远离实验室的地方弃掉,使用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸没消毒后统一处理,如焚烧处理等;
  
  (4)扩增产物分析区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质,应尤其留意实验人员的安全保障。
  
  5、完善的实验室配套设施
  
  完善的实验室配套设施是确保实验运行的必备条件,应依据每个实验室实验内容的不同配置相对的设备和仪器,如超净工作台、离心机、加样器等。

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